（6）结果判定

免疫组化的结果判定有两种方式：

一是对以测量结果阴性细胞指数来定性(如核抗体的标记)，判断方式是以一个规野中阴性细胞数不总细胞癿比率，再取10个相同视野算取平均指数。

另一种方式以染色阴性硬度和阴性检出率相结合而定，一般阴性细胞数在0-25为阳性，25-50为十，50-75为十十，75以上为十十十。此种判别方式容易出现人为偏差现象。有条件的实验室最好能用图象剖析系统进行结果测量定量分析更为确切。一切的判断方式都是力求让免疫组化染色结果判定更标准，但各单位采取的标准不尽相同，所以判定标准化问题还有待常年实践中病理学术界接洽判断标准。

IHC中常见的抗体抒发模式有以下几种：

1）细胞浆内弥漫性分布，多数胞浆型抗原的反应这么，如细胞角蛋白(cytokeratin，CK)和波形蛋白(vimentin)等；

2）细胞核周的胞浆内分布，其判断要点是细胞核的轮廓被描绘得太清楚，如CD3多克隆抗体的染色；

3）胞浆内局限性条状阴性，如CDl5抗原的染色；

4）细胞膜线性阴性，大多数淋巴细胞标记的染色这么，如CD20、CD45RO；

5）细胞核阴性，如Ki-67及雌、孕激素受体蛋白ER、PR等。一种抗原可同时出现。

细胞浆和细胞膜的阴性抒发，如EMA可呈膜性和胞浆内弥漫性阴性反应；CD30抗原可同时呈膜性和胞浆内条状阳性反应等。

（7）对相片癿设置

免疫组化的质量取决于正确使用各类对照，没有对照的免疫组化结果是毫无意义的。对照包括阳性对照、阳性对照和自身对照。在实践中可用染色组织切块中不含抗体的组织作为阳性对照，而用含抗体的正常组织作阴性对照，这种自我对照具有节省的意义。观察染色结果时，先观察对照组织的结果，如阴性对照组织中阴性细胞呈强阴性，阴性对照细胞呈阳性，内源酶阳性，背景无非特异性染色时，表明本次实验的全部试剂和全过程技术操作确切无误，待检组织中的阴性细胞也就是可信的正确结果。 免疫组化染色中对相片的设置特别重要，它是判定您的染色是否成功的关键根据，而且也是监测每一个抗原的质量标准，常设的对照如下，一般实验最常用的只选第二种方式。

1）空白对照(阴性对照) 第一抗原由PBS或非免疫血浆替代。

2）阳性对照 用已知富含要检查抗体的切块作阴性对照。

3）回收实验阳性对照 已知抗体不相应的第一抗原混和，发生结合沉淀，再用此沉淀抗原复合物进行免疫组化实验，结果为阳性。

4）替代对照 用于第一抗原同种植物的血浆或无关抗原取代第一抗原结果为阳性。

5）自身对照 在同一切块上免疫组化染色实验原理，应将不同组织成份中的阴性戒阳性结果不检查的目的物对照比较。如actin、CD34在正常组织中的血管壁肌层应为阴性，vimentin可以间质细胞，对照desmin以血管壁及肌束为对照，S-100蛋白以小神经末梢为对照等，如果应为阴性飞组织是阴性，则免疫组化技术正确，如为阳性，则表明染色技术有问题或免疫试剂质量有问题。

免疫组化染色

一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：

1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃ 1小时）。

（1）二甲苯、II，各10分钟。

（2）梯度酒精：100%，2分钟 95%，2分钟 80%，2分钟 70%，2分钟。

（3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。

2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟（避光）。

3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。

4．抗体修补：根据待测量的抗体，选择适当的方式。

附：抗原修复液（10mM pH 6.0柠檬酸钠缓冲液）的配制

（1）储备液的配制：A液：柠檬酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000ml B液：柠檬酸21g + 蒸馏水1000ml

（2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸馏水900ml

抗原修补的方式：

（1）高压锅处理技术：柠檬酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切块,盖上锅盖，高压锅内煮熟,上汽3分钟后平缓冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。

（2）微波处理技术：用塑胶切块架，置亍塑胶或耐温玻璃容器内，柠檬酸钠缓冲液吞没切块，选择中高或高端，5分钟；叏出并补充已预热的柠檬酸钠缓冲液；再选择中高戒高端，5分钟。（最佳水温为92-95℃）

（3）酶消化处理：此略抗原修复的注意事项：

1）组织不能干。

2）选择抗原修复方式要因抗原而异。

3）该方式主要用亍10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。

4）抗原修补后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。

5、PBS：5分钟，2次（置于摇床）。

6、正常血浆封闭：从染片缸中出取切块，擦冷切块反面水份及切块正面组织

周围的水份（保持组织呈湿润状态）,滴加正常绵羊戒兔血浆（不第二抗原同源植物血浆）处理，37℃，15分钟。

附：正常血浆配制 (或按试剂盒规定的含量配制)

按1:20比列,用PBS配制,每张切块需要量按50ml+5ml (10%抛洒量)计算。

7、滴加第一抗原：用滤纸吸去血浆，不洗，直接滴加第一抗原，37℃、2小时 。

（也可放在4℃冰箱过夜）。

8、PBS：5分钟，2次（置于摇床）。

9、滴加生物素化的二抗，37℃，40分钟。

10、PBS：5分钟，2次（置于摇床）。

11、滴加三抗 （SAB复合物），37℃，40分钟。

12、PBS：5分钟，2次（置于摇床）。

13、DAB显色，镜下观察，适时中止（自来水冲中止）。

附：DAB的配制

（1）储备液(DAB 25mg/ml)癿配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶化后分装成1ml,100ul,50ul，20ul等，—20℃，冻存。

（2）工作液：DAB储备液20ul + PBS 1000ul + 3% H2O2 5ul

14．自来水（细水）充分冲洗。

15．苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。

16．自来水冲洗返绿，15分钟。

17．梯度酒精脱水：

80%，2分钟 、95%，2分钟 、100%，2次，5分钟。

18．二丙酮透明：

I，II（二甲苯）各5分钟。

19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。

二、细胞爬片的免疫疫组化染色： 1. 取出细胞爬片免疫组化染色实验原理，迅速置入冷乙醇固定20-30分钟。

2. 蒸馏水曝晒5分钟，2次。

3. 打孔液曝晒5分钟。

4. 蒸馏水曝晒5分钟，2次。

5. 后接前述实验步骤的第6步（正常血浆封闭）。

注：第3、4步仅用于测量细胞内抗体，检测细胞膜抗体时不用。

三、冰冻切片的免疫组化染色：

1、新鲜组织立刻在恒冷冰冻切片机内切块(也可-80℃保存),厚度为5～6mm。

2、载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。

3、如不马上染色，可密封后-20℃保存。

4、染色前用冷乙醇在4℃固定10-20分钟。

5、PBS洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)

6、3% H2O2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光；

7、用PBS洗2次,每次5分钟；

8、接上面实验步骤第六步。

四、载玻片的预处理：

1、洗衣粉液曝晒30分钟，冲洗，晾干。

2、洗液 （含弱酸、高锰酸钾等）浸泡24小时，冲洗，晾干。

3、APES（1:50乙醇碱液）10-20秒（注意：不能用塑料容器及塑胶切块架）。

4、纯乙醇I，约10秒。纯乙醇II，约5秒。

5、晾干或烤炉内蒸熟，备用。